Quy trình phát hiện đột biến gene 23S rRNA và gyrA

Là loại vi khuẩn Gram (-), vi hiếu khí, sống trong niêm mạc dạ dày người, vi khuẩn Helicobacter Pylori (HP) xuất hiện ở 70-90% dân số Việt Nam - một tỷ lệ rất cao so với thế giới. Theo TS. Nguyễn Tuấn Anh - Phụ trách Chuyên môn Trung tâm Đào tạo và Chẩn đoán Y Sinh học phân tử (Bệnh viện ĐH Y Dược TP.HCM), trong số những người nhiễm HP, có khoảng 10-15% có thể diễn tiến thành viêm loét dạ dày mãn tính, và từ 1-2% có thể phát triển thành ung thư dạ dày và những loại ung thư khác như ung thư biểu mô tuyến dạ dày hoặc u MALT (u mô bạch huyết liên quan đến niêm mạc dạ dày).

“Hiện nay, có năm loại thuốc đang được sử dụng và kết hợp sử dụng để tiệt trừ HP là Amoxicillin, Clarithromycin, Metronidazole, Tetracycline và Levofloxacin”, TS. Tuấn Anh cho biết tại một hội thảo vào cuối tháng 10 của Trung tâm Thông tin và Thống kê Khoa học và Công nghệ TP. HCM (CESTI). Song, do tính chất dịch tễ học của vi khuẩn cũng như do việc sử dụng kháng sinh không đúng của cộng đồng nên ngày càng có nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh xuất hiện, theo một bài báo năm 2019 của Bệnh viện Trung ương Quân đội 108. Kết quả nghiên cứu công bố trên tạp chí Khoa học Tiêu hóa Việt Nam của nhóm TS. Tuấn Anh cũng cho thấy rõ thực tế đáng buồn này: tỷ lệ HP kháng các loại thuốc ở Việt Nam lần lượt là: 71-85,5% đối với clarithromycin; 45-83,6% với metronidazole; 32,2-41,3% với levofloxacin; 10,9-23,8% với tetracycline; và 10,4-17% với amoxicillin.

Tình trạng kháng thuốc như vậy khiến cho việc chẩn đoán và tiệt trừ HP trở nên phức tạp. “Nếu không chẩn đoán chính xác được vi khuẩn HP ở người bệnh kháng với loại kháng sinh nào, bệnh nhân sẽ cứ uống thuốc mà không có ý nghĩa gì cả”, TS. Tuấn Anh cho biết.

Với khoản kinh phí thực hiện đề tài do Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM tài trợ, TS. Nguyễn Tuấn Anh và các đồng nghiệp đã bắt tay vào tìm kiếm giải pháp để hỗ trợ các bác sỹ lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp và dễ dàng hơn.

Không phải trước đây chưa có phương pháp để chẩn đoán xác định kháng kháng sinh. Theo TS. Tuấn Anh, một giải pháp thường được sử dụng cho đến nay là nuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ. Tuy nhiên, “HP là vi khuẩn rất khó nuôi cấy, thường đòi hỏi thời gian nuôi dài - từ 5-7 ngày thậm chí là 14 ngày thì mới cho ra được kết quả”, anh giải thích. Thêm vào đó, điều kiện nuôi cấy cũng không đơn giản: “phải đảm bảo điều kiện tuyệt đối, sau khi nội soi lấy được mẫu sinh thiết thì phải nhanh chóng đưa mẫu đó về phòng thí nghiệm trong vòng ba giờ đồng hồ trong môi trường vận chuyển với thành phần tương đối phức tạp” - anh nói thêm.

Do đó, trong nghiên cứu của mình, nhóm của TS. Tuấn Anh hướng đến việc giải trình tự gene để phát hiện các đột biến kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn HP - một giải pháp có thể rút ngắn thời gian chẩn đoán xuống còn 2-3 ngày. Trong số năm loại kháng sinh đang được sử dụng để tiệt trừ HP, nhóm nghiên cứu nhận thấy ba loại kháng sinh amoxicillin, metronidazole, tetracycline có cơ chế kháng thuốc liên quan tới nhiều loại kiểu gene khác nhau và không phù hợp để chẩn đoán bằng phương pháp giải trình tự gene. Bởi vậy, họ quyết định tập trung vào hai loại kháng sinh clarithromycin - đại diện cho nhóm kháng sinh macrolide, và levofloxacin - đại diện cho nhóm fluoroquinolone để tiến hành nghiên cứu.

Sau khi nghiên cứu và tìm hiểu nhiều tài liệu, nhóm của TS. Tuấn Anh nhận thấy tính kháng thuốc clarithromycin của HP chủ yếu là do đột biến ở trên gene 23S rRNA, và tính kháng levofloxacin chủ yếu do đột biến trên gyrA. Để xác định chính xác các vị trí đột biến chủ đạo và xây dựng một quy trình hoàn chỉnh, nhóm của TS. Tuấn Anh đã lấy và phân tích mẫu của bệnh nhân viêm, loét dạ dày do nhiễm HP (và chưa từng được điều trị tiệt trừ HP) đến khám và điều trị tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh trong khoảng thời gian từ tháng 8/2019 đến tháng 8/2020. Sau quá trình dài nghiên cứu và thử nghiệm, TS. Tuấn Anh và cộng sự đã xây dựng được quy trình thực hiện phát hiện kháng kháng sinh ở vi khuẩn HP gồm các bước: xử lý mẫu và tách chiết DNA từ mẫu sinh thiết của bệnh nhân; phát hiện HP bằng real-time PCR; nhân bản vùng gene kháng bằng PCR; gửi sản phẩm PCR đến các cơ sở để giải trình tự gene; và phân tích kết quả giải trình tự gene xem có mang đột biến kháng thuốc hay không dựa trên ngân hàng dữ liệu NCBI (Hoa Kỳ).

Để cho ra được một quy trình có vẻ đơn giản và dễ dàng áp dụng trong thực tế như vậy, nhóm của TS. Tuấn Anh đã đưa vào trong đó rất nhiều cải tiến. Thông thường, khi một bệnh nhân đến nội soi dạ dày, “chúng ta thường lấy một mẫu để làm CLOtest xét nghiệm HP và một mẫu làm PCR. Tuy nhiên làm như vậy thì bệnh nhân sẽ phải bị lấy mẫu hai lần, dẫn đến nguy cơ xuất huyết dạ dày rất cao”, TS. Tuấn Anh cho biết. Do đó, nhóm nghiên cứu đã thử nghiệm và đưa ra kết quả cho thấy việc thực hiện PCR trực tiếp trên mẫu nội soi đã làm CLOtest vẫn hoàn toàn khả thi, từ đó giúp bệnh nhân tránh bị sinh thiết dạ dày nhiều lần.

Bên cạnh đó, một kết quả đáng chú ý khác của nghiên cứu còn nằm ở bước phản ứng nhân bản sau khi tách chiết. “Nhóm đã sử dụng phản ứng real time PCR với màu huỳnh quang, thông qua phân tích nhiệt độ nóng chảy để biết được mẫu đó có sản phẩm nhân bản dương tính hay không, từ đó lấy sản phẩm gửi đi giải trình tự trực tiếp luôn mà không cần phải thông qua việc điện di như thông thường”, TS. Tuấn Anh cho biết. Đây là một cải tiến quan trọng bởi “trong PCR, nếu chúng ta sử dụng điện di để kiểm tra sản phẩm giải trình tự thì nguy cơ ngoại nhiễm cho những lần sau rất là cao”, TS. Tuấn Anh giải thích.

Để đánh giá kết quả chẩn đoán từ phương pháp giải trình tự gene, nhóm nghiên cứu đã lấy 110 mẫu HP để nuôi cấy - làm kháng sinh đồ và so sánh với phương pháp giải trình tự gene. Kết quả cho thấy, đối với kháng sinh clarithromycin, phương pháp giải trình tự gene có độ nhạy đạt 97,1%; độ đặc hiệu là 80,49%; giá trị chẩn đoán dương tính, âm tính đều trên 90%; “đặc biệt là độ chính xác đạt 92,95% so với phương pháp nuôi cấy”, TS. Tuấn Anh cho biết. Tương tự, với levofloxacin, giá trị chẩn đoán cũng đạt tương tự với độ chính xác trên 90%. “Bằng phương pháp thống kê này, chúng tôi chứng minh được quy trình của nhóm là tối ưu, có thể được sử dụng trong lâm sàng để giúp cho bác sĩ có được công cụ sàng lọc những bệnh nhân có nhu cầu điều trị tiệt trừ HP, và chọn lựa cho họ một phác đồ phù hợp”, anh nhấn mạnh. Đây là một kết quả rất khả quan bởi chi phí để giải trình tự dao động từ 600.000 đồng cho tới 1 triệu đồng cho một lần làm với cả hai loại thuốc, không chênh lệch nhiều so với mức giá của phương pháp nuôi cấy – kháng sinh đồ, vốn tiêu tốn khoảng từ 1.500.000 - 1.800.000 đồng cho năm loại thuốc.