Nghiên cứu tạo giống bạch đàn Urô (Eucalyptus Urophylla) sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen

Ngoài ra, gỗ Bạch đàn còn được sử dụng để sản xuất ván dăm, ván sợi xuất khẩu, làm đồ mộc, cột chống, lá của một số loài được sử dụng để tách chiết tinh dầu, tanin và chế biến dược phẩm.

Với giá trị to lớn của cây bạch đàn, việc ứng dụng kỹ thuật di truyền trong tạo giống cây bạch đàn chuyển gen sinh trưởng nhanh, chất lượng tốt và chống chịu tốt với môi trường bất lợi là rất cần thiết. Nghiên cứu chuyển gen vào bạch đàn đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm và thu được một số giống bạch đàn biến đổi gen có những tính trạng quý: Bạch đàn chuyển gen (C4H, antisense CAD, LIM domain transcription factor) giảm hàm lượng lignin (Chen et al., 2001; Valerio et al., 2003; Kawaoka et al., 2006); bạch đàn chuyển gen CecropinD kháng được bệnh gây ra bởi Pseudomonas solanaceanum (Shao et al., 2002); bạch đàn chuyển gen (coda 12-5B, codA 12-5C, codA 20-C, P5CS) tăng cường khả năng chịu mặn và hạn (Kikuchi et al., 2006; Dibax et al., 2010). Các giống bạch đàn chuyển gen đang được gây trồng khảo nghiệm để đưa vào sản xuất.

Hiện nay, để cải thiện giống cây trồng lâm nghiệp sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen, có hai hướng chính là chuyển các gen liên quan đến sinh tổng hợp chất điều hòa sinh trưởng dạng hoạt động (như gen GA20) và các gen liên quan đến việc nâng cao hiệu quả sử dụng nitơ, phốt pho (gen GS1, phyA). Gen GS1 mã hóa cho cytosolic glutamine synthetase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp glutamine từ glutamic acid và NH4+, tăng cường khả năng hấp thu và tái sử dụng hiệu quả nguồn nitơ (Miflin và Lea, 1980) và gen phyA mã hóa cho Phytases (InsP6 phosphohydrolase) là một lớp đặc biệt của phosphatases - chất xúc tác cho sự thủy phân từng bước phytate - một dạng P hữu cơ có nhiều nhất trong đất (Turner et al., 2002); tăng cường hoạt động của cytosolic glutamine synthetase (GS1) và Phytase sẽ giúp cây sử dụng hiệu quả nguồn nitơ và phốt pho vốn là nhu cầu thiết yếu cho cây sinh trưởng. Nếu gen GS1 và phyA hoạt động mạnh thì cây trồng trong điều kiện đầy đủ hoặc nghèo nguồn nitơ và phốt pho cây vẫn có khả năng sinh trưởng nhanh (Stéphanie và cs., 2009). Điều này hết sức có ý nghĩa đối với cây nông nghiệp và đặc biệt là cây lâm nghiệp. Vì phần lớn các vùng đất được quy hoạch để trồng rừng chủ yếu là đồi núi trọc, đất bạc màu nghèo dinh dưỡng, bên cạnh đó việc áp dụng các biện pháp canh tác tích cực đối với cây lâm nghiệp là rất khó khăn, những yếu tố hạn chế này làm cho năng suất rừng trồng không cao. Do vậy việc nghiên cứu tăng cường hoạt động của gen GS1 và phyA bằng cách thiết kế promoter mạnh rồi chuyển vào các giống cây lâm nghiệp sẽ cải thiện được đặc tính sinh trưởng, nâng cao được năng suất rừng trồng. Cây Dương lai chuyển gen GS1 sinh trưởng nhanh hơn nhiều so với cây không chuyển gen ở giai đoạn cây con và trồng rừng (Gallardo et al., 1999; Zhong et al., 2004); cây thuốc lá chuyển gen GS1 cho thấy mức độ phiên mã và tổng hợp glutamine synthetase tăng cao, cây sinh trưởng nhanh hơn so với cấy đối chứng (Fuentes et al., 2001). Gen GA20 mã hóa GA20-oxidase có hoạt tính xúc tác cho 3 phản ứng oxy hóa liên tiếp: GA12/GA53 → GA15/GA44 →GA24/GA19→ GA9/GA20 (Lange et al., 1997; Eriksson et al., 2000). Trong đó, GA9/GA20 là dạng tiền chất trực tiếp để chuyển hóa thành dạng GAs hoạt động (GA4/GA1) có tác dụng kích thích biệt hóa và kéo dài tế bào ở mạch xylem, làm cho cây tăng trưởng về chiều cao và đường kính (Eriksson et al., 2000; Busov et al.,2003). Cây Dương lai (Populus tremula x P. tremuloides) chuyển gen có tốc độ sinh trưởng nhanh và sinh khối tăng cao hơn so với dòng không chuyển gen (Eriksson et al., 2000). Như vậy, việc lựa chọn gen GS1 và GA20 để chuyển vào Bạch đàn urô nhằm cải thiện khả năng sinh trưởng là có cơ sở khoa học và thực tiễn.

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Lâm nghiệp phối hợp với Chủ nhiệm đề tài: TS. Bùi Văn Thắng thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) sinh trưởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen”. Nghiên cứu nhằm xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển một số gen đích (gen GA20 và GS1) liên quan đến tính trạng sinh trưởng nhanh vào Bạch đàn urô góp phần tạo giống bạch đàn chuyển gen sinh trưởng nhanh.

Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đã thu được những kết quả sau:

Các sản phẩm được tạo ra đủ và đảm bảo tiêu chuẩn kỹ thuật đúng kế hoạch đã đăng ký trong hợp đồng nghiên cứu Khoa học và phát triển với Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn và Thuyết minh tổng thể đề tài.

1) Phân lập được gen 01 gen GA20, 02 gen GS1 có trình tự mã hóa hoàn chỉnh; tổng hợp nhân tạo được gen PhyA-cmyc và GS1-cmyc và 01 GRP1.8 promoter, 01 Ubiquitin promoter.

2) Thiết kế được 04 cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen GS1/GA20/phyA (pBI121-GA20, pBI121-GS1, pBI121-GS1-cmyc và pBI121- PhyA-cmyc) và đã tạo được các chủng A. tumefaciens mang mang các cấu trúc vector chuyển gen này.

3) Xây dựng được quy trình tái sinh Bạch đàn urô thông qua tạo phôi soma và chồi bất từ mô sẹo hiệu suất cao định phục vụ chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.

4) Xây dựng được quy trình chuyển gen vào Bạch đàn urô thông qua vi khuẩn A. tumefaciens (hiệu suất chuyển gen Gus 3,7%); áp dụng quy trình đã chuyển thành công gen Gus/GA20/GS1 vào Bạch đàn urô.

5) Tạo được 45 dòng Bạch đàn urô chuyển gen AtGA20/PtGA20 và 41 dòng chuyển gen GS1 ra rễ trên môi trường chọn lọc 75 mg/l kanamycin và dương tính với gen nptII bằng PCR. Chứng minh đượng 6 dòng chuyển gen AtGA20 và 5 dòng chuyển gen GS1 bằng phương pháp lai southern. Nhân giống các dòng chuyển gen AtGA20 gồm E-GA1, EGA2, E-GA3, E-GA4, E-GA13 và E-GA18 với số lượng 2751 cây. Nhân giống các dòng chuyển gen GS1 gồm E-X7, E-X16, E-X17, E-X20 và E-X29 với số lượng 1500 cây.

6) Đánh giá sinh trưởng của các dòng Bạch đàn urô chuyển gen AtGA20 ở giai đoạn nhà lưới (3 tháng tuổi) vượt so với dòng không chuyển gen từ 13,29% - 42,83% và sinh khối tươi toàn cây tăng với đối chứng từ 6,64% - 40,49%. Ở giai đoạn vườn ươm 4 tháng tuổi, các dòng chuyển gen AtGA20 sinh trưởng nhanh hơn so với đối chứng từ 21,36% - 50%.

7) Đánh giá sinh trưởng của các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 ở giai đoạn nhà lưới (3 tháng tuổi) vượt so với dòng đối chứng không chuyển gen từ 17–28,3% và sinh khối tươi toàn cây tăng so với đối chứng từ 13,11% - 25,11%.

8) Công bố được 05 bài báo và 01 bài đang phản biện; đào tạo được 08 kỹ sư ngành CNSH; 02 Thạc sỹ CNSH và 02 NCS (01 NCS bảo vệ thành công cấp Trường, 01 Đã bảo vệ thành công cấp cơ sở).