RT-PCR thời gian thực: “Chuẩn vàng” để xét nghiệm SARS-CoV-2

Hiện nay, về cơ bản có hai cách xét nghiệm virus SARS-CoV-2: 1) xác định trực tiếp sự tồn tại của virus trong mẫu bệnh phẩm; 2) tìm kháng thể hoặc kháng nguyên đặc hiệu kháng virus trong mẫu máu của người nghi nhiễm. Và kỹ thuật Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực (Real time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) - hay ngắn gọn là “RT-PCR thời gian thực” là một trong những phương pháp phổ biến nhất để xét nghiệm SARS-CoV-2.

RT-PCR thời gian thực là phương pháp có nguồn gốc kỹ thuật hạt nhân dùng để phát hiện một cách trực tiếp sự hiện diện của vật liệu di truyền đặc trưng từ nhiều mầm bệnh khác nhau, bao gồm cả virus. Ban đầu, phương pháp này sử dụng chất đánh dấu đồng vị phóng xạ nhưng sau đó được cải tiến và thay thế bằng thuốc nhuộm huỳnh quang. Với kỹ thuật này, kết quả xét nghiệm gần như được trình diễn một cách tức thời trên màn hình máy tính khi quá trình phân tích đang diễn ra, vì vậy được gọi là RT-PCR thời gian thực. Giải Nobel hóa học năm 1993 được trao cho nhà hóa sinh người Mỹ Kary Mullis cho phát minh phương pháp phản ứng chuỗi polymerase (PCR).

Để hiểu RT-PRC, chúng ta cần hiểu virus và vật liệu di truyền:

Virus là một gói vật liệu di truyền nhỏ được bao bọc bởi một lớp vỏ phân tử. Vật liệu di truyền có thể là DNA hoặc RNA.

DNA là phân tử chuỗi kép có ở tất cả các sinh vật như động vật, thực vật và virus; DNA mang mã di truyền quyết định cách thức sinh vật được tạo ra và phát triển.

RNA nhìn chung là phân tử chuỗi đơn thực hiện việc sao chép, phiên mã và truyền một phần mã di truyền tới protein để protein có thể tổng hợp và thực hiện các chức năng làm cho sinh vật có thể sống và phát triển.

Một số virus như SARS-CoV-2 chỉ chứa RNA, do đó, để tồn tại và nhân lên, chúng phải xâm nhập vào các tế bào khỏe mạnh. Khi đã ở trong tế bào, virus sử dụng mã di truyền của nó -với virus corona là RNA - để kiểm soát và 'tái lập trình' các tế bào, biến chúng thành những nhà máy sản xuất virus.

Để phát hiện một loại virus như virus corona sử dụng RT-PCR thời gian thực, các nhà khoa học cần phải chuyển đổi RNA của virus thành DNA. Quá trình này gọi là phiên mã ngược, là một khâu phải thực hiện vì việc sao chép/khuếch đại chỉ có thể được thực hiện với DNA mà không thể thực hiện trực tiếp với RNA. Thực chất, khuếch đại số lượng đoạn ngắn DNA của virus lên bội lần là cốt lõi của phương pháp RT-PCR. Đây là bước hết sức quan trọng giúp các nhà khoa học có một lượng lớn DNA để có thể xác định sự tồn tại của virus một cách chính xác thay vì cố gắng phát hiện một lượng DNA rất nhỏ trong số hàng triệu chuỗi thông tin di truyền trong mẫu.

Đầu tiên, mẫu bệnh phẩm được thu thập ở nơi virus corona tập trung nhiều, chẳng hạn như trong họng hoặc mũi. Sau đó, mẫu được xử lý bằng hóa chất để loại bỏ một số chất protein và chất béo, chỉ giữ lại RNA có trong mẫu. RNA thu được là sự trộn lẫn vật liệu di truyền của cả người nghi nhiễm và RNA của virus corona.

RNA được phiên mã ngược thành DNA bằng cách sử dụng một enzim đặc biệt gọi là Taq Polymerase. Đây là enzyme được sử dụng phổ biến trong RT-PCR, có khả năng tổng hợp nên DNA mới từ một trong hai chuỗi của DNA cũ. Tag Polymerase được phân lập từ loài vi khuẩn có tên là thermus aquaticus sống ở những suối khoáng nóng do đó nó có khả năng chịu nhiệt rất tốt và hoạt động hiệu quả nhất ở nhiệt độ cao khoảng 70^oC. Bước tiếp theo, các nhà khoa học thêm vào các đoạn DNA ngắn, đây là những đoạn DNA giống với một phần DNA của virus. Những đoạn này được thiết kế đặc biệt cho virus corona, chúng sẽ gắn vào DNA đích nếu DNA của virus có trong mẫu. Một số đoạn được thêm vào là những cặp đoạn mồi (primer xuôi/ngược) có vai trò xác định phần DNA của virus cần được khuếch đại. Một số đoạn khác có chứa chất huỳnh quang (TagMan) được thêm vào để đánh dấu các chuỗi DNA của virus, sau đó được sử dụng để phát hiện virus.

Hỗn hợp cuối cùng được đặt vào trong máy RT-PCR bao gồm chất đệm (nhằm tạo ra môi trường hóa học thích hợp cho Taq Polymerase hoạt động ổn định và tối ưu), Taq Polymerase, nucleotide (thành phần cơ bản để tạo nên DNA mới trong quá trình khuếch đại), các cặp mồi, TagMan, và DNA mẫu. Máy RT-PCR thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ nóng và lạnh để kích hoạt phản ứng hóa học tạo ra những bản sao mới, giống hệt với đoạn DNA được quan tâm của virus. Chu trình này được lặp đi lặp lại nhiều lần, sau mỗi chu kỳ lượng DNA lại được nhân đôi: hai bản sao trở thành bốn, bốn trở thành tám, v.v... Một thiết lập RT-PCR thời gian thực tiêu chuẩn thường trải qua 35 chu kỳ, điều đó có nghĩa là vào cuối quá trình, khoảng 35 tỷ bản sao đoạn DNA sẽ được tạo ra từ mỗi chuỗi DNA của virus có trong mẫu.

Khi các bản sao DNA của virus được tạo ra, ánh sáng huỳnh quang phát ra từ các chất đánh dấu gắn vào các chuỗi DNA được đo và biểu diễn theo thời gian thực trên màn hình. Máy tính theo dõi lượng ánh sáng trong mẫu sau mỗi chu kỳ. Nếu lượng ánh sáng đo được vượt qua một ngưỡng nhất định, điều đó đồng nghĩa với việc có virus tồn tại trong mẫu. Số chu kỳ cần thiết để lượng ánh sáng đạt ngưỡng cũng được ghi nhận để ước tính mức độ nhiễm virus: số chu kỳ càng nhỏ, mức độ nhiễm càng nghiêm trọng.

So với các phương pháp phân lập virus khác, RT-PCR thời gian thực có độ nhạy cao, cho kết quả chính xác chỉ trong khoảng 3 giờ. Phương pháp này có độ tạp nhiễm và sai số thấp vì toàn bộ quá trình phân tích có thể được thực hiện trong một ống nghiệm kín. RT-PCR thời gian thực tiếp tục khẳng định là phương pháp chính xác nhất trong phát hiện virus corona. Kỹ thuật này cũng được sử dụng để chẩn đoán các bệnh khác như Ebola, Zika, MERS-Cov, SARS-Cov1 và các bệnh lây nhiễm cho người từ động vật và bệnh trên động vật khác.

Tham khảo: https://www.iaea.org/