Nghiên cứu ứng dụng bức xạ ion hóa kết hợp công nghệ ribosome nhằm cải thiện khả năng sinh protease của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis

Vi sinh vật, đặc biệt là chủng VK Bacillus là nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất protease ở quy mô công nghiệp nhờ việc thu nhận sản phẩm dễ dàng, nuôi cấy đơn giản và đặc biệt protease của chủng VK này có hoạt tính ổn định ở các điều kiện pH, nhiệt độ cao (Olajuyigbe và Ajele, 2005). Tuy nhiên, các chủng Bacillus tự nhiên thường cho năng suất sinh protease không cao và vì thế việc tạo ra các thể đột biến có khả năng sinh sản phẩm thứ cấp vượt trội là một lựa chọn lý tưởng cho ngành công nghiệp sản xuất protease.

Trong tự nhiên, tỷ lệ đột biến phụ thuộc vào điều kiện phát triển của VSV và nằm trong khoảng từ 10-10 đến 10-6. Tỷ lệ này có thể tăng một cách rõ rệt bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm và thực tế có thể lên đến 10-5 đến 10-1 (Davati và cs, 2013). Cơ chế phân tử liên quan được phân tích, đánh giá trong nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tác động này chủ yếu theo hai con đường chính là gây đột biến gen rpsL mã hóa cho protein ribosome S12 và gây đột biến gen rpoB mã hóa cho tiểu phần β của RNAP (Lai và cs, 2002; Ochi, 2007; Ochi và Hosaka, 2013; Wang và cs, 2008). Đây cũng là cơ sở cho sự ra đời của công nghệ ribosome (Ribosome Engineering), một kỹ thuật khá mới liên quan đến việc gia tăng hoạt tính của các ribosome tham gia dịch mã, nhằm mục đích tăng khả năng dịch mã. Như vậy gen đích không hề bị cải biến nhưng khả năng sinh tổng hợp sản phẩm của gen được tăng lên nhờ các đột biến liên quan đến bộ máy tổng hợp ribosome. Kỹ thuật này đã chứng minh được tính hiệu quả, có thể làm tăng khả năng sinh tổng hợp lên hàng chục, thậm chí hàng trăm lần.

Rõ ràng, công nghệ ribosome là một kỹ thuật gây đột biến định hướng, tương đối đơn giản, hiệu quả và đặc biệt chi phí thấp so với công nghệ gen. Tuy nhiên, thời gian sàng lọc đột biến ribosome khá dài, tốn nhiều công sức vì vậy việc sử dụng kết hợp công nghệ ribosome với xử lý chiếu xạ được xem là một giải pháp nhằm làm tăng áp lực chọn lọc, giảm thời gian sàng lọc, tăng tần suất thu được thể đột biến mong muốn, đặc biệt là tăng khả năng kháng với KS của VSV (De Groot và cs, 2005; Al-Sudany và cs, 2010).

Như vậy, cùng với kỹ thuật gây đột biến phóng xạ, công nghệ ribosome có thể giúp tạo ra chủng VSV có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao hơn chủng thuần nhiều lần, giúp tăng khả năng ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu. Vì lý do đó, đề tài "Nghiên cứu ứng dụng bức xạ ion hóa kết hợp công nghệ ribosome nhằm cải thiện khả năng sinh protease của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis" đã được nhóm nghiên cứu Phòng Nghiên cứu Công nghệ Bức xạ do ThS. Trần Băng Diệp đứng đầu thực hiện. Đây là nghiên cứu khởi đầu kết hợp giữa công nghệ bức xạ với công nghệ ribosome tại Việt Nam.

1. Đã tuyển chọn được 03/09 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh protease cao và ổn định sử dụng làm nguyên liệu gây tạo đột biến. Đó là các chủng Bacillus subtilis B5, Bacillus subtilis H12 và Bacillus subtilis VI.

- Thời gian nuôi cấy 24 giờ và kiểm tra hoạt tính enzyme ngay sau khi thu dịch nuôi các chủng Bacillus subtilis được lựa chọn để giảm thiểu mức độ suy giảm hoạt tính protease và phù hợp với điều kiện thực nghiệm của nghiên cứu.

2. Huyền dịch TB ở giai đoạn phát triển theo hàm mũ và đĩa thạch dinh dưỡng có cấy TB của 03 chủng Bacillus subtilis được xử lý chiếu xạ ở dải liều 0-3000 Gy trên nguồn Co-60 tại Trung tâm Chiếu xạ Hà Nội. Dù xử lý chiếu xạ theo cách nào thì tỷ lệ VK sống sót đều giảm theo liều chiếu và đường cong sống sót của chúng tuân theo lý thuyết mô hình truyền năng lượng.

- Đột biến sinh protease cao ở các chủng Bacillus subtilis xuất hiện ở tất cả các liều xạ. Tỷ lệ đột biến cao hơn trong khoảng liều từ 700-1500 Gy so với các liều khảo sát còn lại và kết quả lặp lại ở cả 3 chủng Bacillus subtilis B5, H12 và VI.

3. Tần số đột biến kháng streptomycin (20 µg/ml) và rifampicin (0,2 µg/ml) của cả 03 chủng VK nghiên cứu đều tăng đáng kể nhờ xử lý chiếu xạ. Tần số biến kháng streptomycin lớn nhất là 1,61x10-3, 1,68x10-2, 2,22x10-2 tương ứng lần lượt với các chủng B5, H12 và VI gây ra bởi liều chiếu xạ 1000 Gy. Trong khi đó, tần số đột biến kháng rifampicin của chúng đạt giá trị cao nhất ở liều 2000 Gy, cao hơn tần số tự phát từ 1,55-5,46x103 lần.

- Sử dụng kết hợp chiếu xạ tia gamma và xử lý KS cũng như tăng dần nồng độ streptomycin và rifampicin trong quá trình sàng lọc đã tạo ra 17 khuẩn lạc kháng xạ, kháng KS có khả năng sinh protease vượt trội so với các chủng thuần ban đầu.

4. Kết quả giải trình tự cho thấy14/17 khuẩn lạc đều mang đột biến thay thế ở gen rpoB. Không có bất kì đột biến nào trên gen rpsL được phát hiện ở tất cả các khuẩn lạc nghiên cứu, chứng tỏ tính kháng KS và khả năng tổng hợp protease cao hơn chủng thuần chỉ liên quan đến gen rpoB chứ không chịu tác động của thay đổi nucleotide ở gen rpsL.

- Trong số các đột biến thì dòng 609-B5 (tạo được nhờ chiếu xạ liều 500 Gy chủng thuần Bacillus subtilis B5 kết hợp xử lý streptomycin 200 µg/ml) và dòng19-H12 (tạo được nhờ chiếu xạ liều 1000 Gy chủng thuần Bacillus subtilis H12 kết hợp xử lý rifampicin 10 µg/ml) có khả năng sinh protease cao hơn 2,5-2,7 lần so với chủng gốc và ổn định so với các chủng còn lại.

- Có hai thay đổi amino acid xảy ra ở vị trí 494 ở dòng 609-B5 và vị trí 496 ở dòng 19-H12. Cả 2 đột biến này đều nằm trong vùng qui định tính nhạy cảm với KS của tiểu phần beta của RNA polymerase liên quan đến khả năng tăng tổng hợp protease ở Bacillus.

- Trình tự nucleotide gen rpoB của dòng 609-B5 và dòng 19-H12 đã được đăng ký trên NCBI (National Center for Biotechnology Information) với mã số MG 023321 và MG 023320. Đồng thời, 02 plasmid chứa gen rpoB đột biến của chúng đã được tái tổ hợp, biến nạp và tách chiết thành công.

5. Phương pháp mô hình hóa RSM - CCD kết hợp với phần mềm tin sinh Design Expert và kiểm tra bằng thực nghiệm đã xác định điều kiện tối ưu của bốn yếu tố trong nuôi cấy dòng đột biến 609-B5 thu protease cực đại là 2299,49 UI/ml ở các giá trị hàm lượng hàm lượng pepton 6,5 g/l, hàm lượng cao thịt 2 g/l, pH 7,16, thời gian nuôi cấy là 21 giờ. Hoạt độ protease nhận được từ kết quả thực nghiệm với các giá trị mô hình dự đoán là 2257,32 UI/ml, chứng tỏ tính chính xác của mô hình và sự tồn tại của điểm tối ưu.